6-20 Science：发现新一类基因沉默的小RNA—piRNA
日期：2006-06-20 访问次数：3564
生物谷博客报道：非编码性的小RNA调节着一些对细胞生长和发育必需的过程，包括mRNA降解，翻译抑制，转录阶段基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS)。在哺乳动物中寻找造成TGS的因子过程里，作者纯化出一个含有小RNA和Riwi(老鼠中的人类Piwi的同源物)。这些RNA，长度通常在29-30nt，被称为与Piwi相互作用作用的piRNA复合物的(piRC)制备物中含有rRecQ1，其中rRecQ1是脉孢菌(Neurospora) qde-3基因表达蛋白的同源物，该基因参与沉默途径作用。Piwi在苍蝇里就已与TGS在遗传上联系起来，也与纯化的piRNA复合物的具有切割活性的共分级分离(cofractionate)物联系。这些结果就与piRC中存在着一个基因沉默作用相一致。该研究成果已经发表在06年06月15日的《Science》杂志的网络版Sciencexpress上。
小RNA指导的基因沉默途径或在转录阶段上发挥作用，或在转录后阶段上发挥作用。转录后基因沉默通过mRNA去稳定化或者mRNA翻译抑制起作用，而转录阶段基因沉默则是通过改变染色质构象抑制基因表达。这两个途径均利用一个核心复合物，该复合物含有小RNA和Ago(Argonaute)蛋白家族的一个成员。然而，它们之间不同的机制也意味着复合物的组成上也有差别。小RNA介导的TGS虽然在裂变酵母和其他真核生物中已被研究，但是在哺乳动物中这个过程的机制仍然有待阐述。
通过将制备的老鼠睾丸粗提物进行离子交换Q柱分离，分成流出物和洗脱物两部分，同时监控小RNA，构建cDNA文库后进行测序，发现流出物中的RNA主要是microRNA(miRNA)，洗脱物中的RNA(69%)主要是从那些平常被认为不能表达的基因组区域获得的，长度大多在25-31nt，而且Northern印迹分析也显示出一个睾丸特异性的特征。大多数的洗脱物中RNA5’端大多以尿苷开始(约84%)，但没有特征性序列或基序被检测到。而且，在洗脱物中RNA观察到一个明显的亚群体(subpopulation)长度在29-30nt，然而它们与洗脱物中的其他的RNA无论是在5’核苷，基因组上的位点，还是注释上都不能去区别开来。因此，所有洗脱出的RNA不能与已经注释的非编码性的RNA(miRNA, tRNA, rRNA, snRNA)配备，而一起被认为代表着新鉴定出的一类小RNA。
随后又通过五步的实验程序纯化与这类小RNA作用的蛋白，质谱结果鉴定出老鼠中存在人类Piwi和RecQ1蛋白的同源物(分别称为Riwi和rRecQ1)。Western印迹结果也证实Riwi和rRecQ1与这些小RNA共纯化。因此，作者将这类小RNA命名为与Piwi相互作用的RNA(piRNA)，并将与老鼠Piwi同源物一起形成的复合物称为piRNA复合物。
已知的起沉默作用的RNA(siRNA, miRNA)起源于双链RNA前体物或者呈折叠结构的RNA。不同于miRNA和siRNA，piRNA中的94％能对应到基因组中100个确定的区域(每个区域长度小于100kb)。在在这些区域里，piRNA通常只沿着基因组的一条链分布，或有时不规则地分布在两条链上，但是相互分开，而不重叠在一起，但是都没有证据表明piRNA起源于折叠的结构或双链RNA。piRNA在基因组上的位点分析表明大约2/3的piRNA序列中的每个都完美地配备单个位点，不过也一些情况下也单个位点被多个piRNA序列配备上。此外，Northern印迹分析也表明piRNA主要起源于基因组双链中的一条链。
人类的RecQ1是一个ATP依赖性的DNA解旋酶，它的ATPase和DNA解旋活性在piRC中的rRecQ1蛋白也存在。Riwi含有催化性的氨基酸残基，这些残基在其他的Ago家族蛋白中被用来进行RNA指导的靶标RNA切割。通过使用与piRNA互补的底物，也能检测到切割活性，尤其是在含有Riwi和piRNA的组分中活性最高，然而，活性不强健，这可能是不同piRNA组成的总体中相关的piRNA所占比重较小(〈0.2%)的缘故。
Piwi蛋白代表着Ago蛋白家族中的一个分支(subclade)，首次在在果蝇(Drosophila)中发现，起着调节生殖干细胞维持的作用。随后也发现哺乳动物的Piwi蛋白成员调节着生殖细胞的成熟。piwi基因突变的果蝇在小RNA依赖性的转基因和逆转座子沉默上存在缺陷，同时也丧失了异染色质蛋白的。四膜虫(Tetrahymena) Piwi (TIWI)对siRNA调节的DNA降解是必需的。
脉孢菌中，在筛选破除营养生长阶段的基因沉默的过程中鉴定出QDE-2(Ago蛋白家族的一个成员)和QDE-3(RecQ1同源物)。当比较RecQ在哺乳动物和其他有机体中的同源性时，脉孢菌的QDE-3与老鼠的rRecQ1处于同一个分支里。在最后的纯化步骤中，rRecQ1并不总是精确地与Riwi和piRNA共分级分离。rRecQ1这种紧密相互作用的缺乏可能反映了最后一步的条件特异性，或者表明了rRecQ1通常就要比Riwi与piRNA的结合紧密性要弱。然而，沉默因子QDE-2和QDE-3之间的遗传连接关系暗示Riwi与rRecQ1之间的的生化结合作用有着重要的生物学意义，进一步说明对piRC而言存在着一个基因沉默的功能。阐述piRC的功能性作用和理解piRNA家族的起源将是揭示出piRC在基因组的调节作用的重要性问题。(翻译：David Towersimper)
摘自：生物谷
